1、限制性核酸内切酶是如何命名的？怎样理解其识别序列的特异性和切割位点的特异性？

　　限制性核酸内切酶的命名，目前主要以Smith和Nathans的命名系统为基础，后多个国家和地区的研究者在此基础上对其作了补充规定。限制性核酸内切酶命名的主要规则有：①酶的基本名称由寄主微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母构成，书写时属名的第一个字母为大写、斜体，种名的前两个字母为小写、斜体。②若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母，书写时该字母为小写、正体。③若某一种寄主菌株，具有几个不同的限制-修饰体系，则以正体罗马数字表示。④除了以上规定外，基本名称前面一般还应带有系统名称，限制性核酸内切酶为“R”，甲基转移酶为“M”，中间用“.”隔开。若上下文含意十分清晰，系统名称可省略。例如，“M.HindⅢ”中“M”为甲基转移酶的系统名称，“Hin”为流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）的基本名称，“d”为该菌品系的第一个字母，“Ⅲ”为该菌不同限制-修饰体系的序号。

　　已经鉴定出的限制性核酸内切酶有4种不同类型：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶和Ⅳ型酶，其中Ⅱ型酶为基因工程中最常用的工具酶，其余则很少或尚无应用，因为只有Ⅱ型酶既能识别特定的核苷酸序列，又能在固定位置切割双链DNA分子，所以我们通常所说的“限制性核酸内切酶”其实就是指“Ⅱ型限制性核酸内切酶”。Ⅱ型限制性核酸内切酶识别碱基序列并非全部是严格的专一，如EcoRⅠ识别序列为5′-GAATTC-3′，而BstNⅠ识别序列为5′-CCWGG-3′（W为A或T），MaeⅢ识别序列为5′-GTNAC-3′（N为任意碱基），HindⅡ可识别4种核苷酸序列即5′-GTYRAC-3′（Y为C或T，R为A或G）。

　　大多数Ⅱ型限制性核酸内切酶在识别序列处特异性切割双链DNA分子，水解磷酸二酯键，产生3′端羟基、5′端磷酸基团的DNA片段。其酶切位点一般在识别序列内部，少数酶切位点在识别序列的两侧，如BamHⅠ的酶切位点是5′-G↓GATCC-3′，MboⅠ的酶切位点是5′-↓GATC-3′（“↓”处为酶切位点，下同）。酶切后产生的片段末端有黏性末端和平末端等形式，若在识别序列双侧进行切割，会产生5′黏性末端或3′黏性末端，若在识别序列的对称轴上切割，则形成平末端。

　　来源各异的不同种限制性核酸内切酶也有可能识别序列相同、切割位点相同或产生相同黏性末端。若不同种限制性核酸内切酶识别序列相同，但切割位点不同，它们互为新裂酶，如AatⅡ、ZraⅠ识别序列相同，但切割位点分别为5′-GACGT↓C-3′、5′-GAC↓GTC-3′。若不同种限制性核酸内切酶识别序列和切割位点均相同，则称为同切点酶（同裂酶），如HpaⅡ、MspⅠ识别序列和切割位点均为5′-C↓CGG-3′。若不同种限制性核酸内切酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶，如BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ、XhoⅡ为一组同尾酶，它们的识别序列和切割位点依次分别是5′-G↓GATCC-3′、5′-T↓GATCA-3′、5′-A↓GATCT-3′、5′-↓GATC-3′、5′-R↓GATCY-3′，它们切割DNA后都形成由GATC组成的黏性末端。由同尾酶酶切产生的DNA片段，能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。

　　2、引物都是DNA片段吗？

　　引物(primer)是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，它与DNA母链的一段碱基序列互补配对，在生物体内的DNA复制和人工扩增DNA的聚合酶链式反应(PCR)过程中发挥重要作用。

　　在生物体内DNA复制中，由于DNA聚合酶只能把核苷酸连接到已经形成的和DNA模板链互补的多核苷酸链上，而不能从头开始把核苷酸连接起来，这个先已存在的多核苷酸链就是引物。该引物不是DNA而是由10个左右核苷酸组成的RNA短链，它是通过引物酶（primase）的作用合成的。每合成一条DNA链，就需要一个引物，故在复制冈崎片断时，每一片断的前段都有一个RNA引物，复制完成后，RNA引物被修复系统移去。

　　在利用PCR技术扩增DNA时，同样由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此引物对（引物Ⅰ、引物Ⅱ）在PCR反应体系的配方中是必须组成成分。用于PCR的引物，其本质是单链的DNA片段，其设计要求主要有：长度一般为16～30bp为宜（通常为20～30个核苷酸——人教版选修1），最佳为20～24bp；G+C含量以40～60%为佳；两个引物之间不应发生互补，以避免形成“引物二聚体”等。

　　3、农杆菌转化法一般不能用于转化单子叶植物吗？

　　利用农杆菌对植物进行转化，首先将目的基因插入到Ti质粒衍生的转化载体上，形成重组DNA，然后将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌，再通过上述农杆菌侵染植物外植体。植物伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物、中性糖，酚类化合物如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（HO-AS）等，一些中性糖如L-阿拉伯糖、D-木糖等，上述物质既是根瘤农杆菌的趋化物，又是农杆菌中毒性基因Vir表达的诱导物，在它们的作用下，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。研究表明，作为主要诱导物的乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮等酚类物质，主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，因此根瘤农杆菌不易直接侵染单子叶植物。但是，后来经过调整和改进有关技术，如选择合适的农杆菌菌株、添加乙酰丁香酮等趋化和诱导物质，农杆菌介导的遗传转化法在水稻、小麦等单子叶植物中也获得成功，从而使其成为一种被广泛地应用于单子叶植物和双子叶植物的遗传转化的方法。这种方法的优点在于简单有效、转化的外源DNA结构完整、整合位点稳定、转化效率高、整合后外源基因结构变异小等，当然单子叶植物的转化率（也可达20%～30%）还是比双子叶植物的转化率（可高达80%～90%）低。

　　4、病毒作为载体是如何携带目的基因进入受体细胞？

　　基因工程中的“分子运输车”除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。教材对质粒的分子结构和工作原理进行了详细的描述，那么病毒是如何携带目的基因导入受体细胞的呢？下面就以λ噬菌体为例，简要介绍其表达载体的构建。

　　迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，这些基因所在区段是噬菌体生长繁殖所必需的，在表达载体构建中为不可替代区；而另一部分基因对于噬菌体生长周期不是必需的，这些基因所在区域就称为可替代区，如果用外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，正是这一特点构成了λ噬菌体作为外源基因表达载体的基础。野生型λ噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：①删除基因组中非必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载外源DNA片段的容量。②在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因。③建立重组λDNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分子运输车”的基本机理。

　　5、目的基因导入受体细胞后，是否整合到受体细胞的核DNA中？

　　目的基因被导入到受体细胞后的分布位置，主要与所选择的运载体和受体细胞等生理特性有关，目的基因进入受体细胞后，有的游离在细胞质中，有的被整合到染色体DNA中。

　　目前经常使用的载体，主要有质粒和病毒两类。携带目的基因的质粒，它本身就是一种稳定而独立的重组DNA分子。因此重组质粒进入受体细胞后，常不需要把所携带的基因转到受体细胞的染色体上去，就会进行自我复制，异源性DNA也得到了复制。另外，叶绿体和线粒体DNA等作为新型运载体，携带目的基因进入受体细胞后，也是游离在细胞质中。

　　除了质粒之外，噬菌体、动植物病毒等也可以作为载体。利用病毒作为基因运载体时，所携带的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中去，才能成为稳定的结构而独立复制传递。例如λ噬菌体侵染细菌后，并不伤害受体细胞地和细菌拟核DNA整合到一起，随着细菌拟核DNA复制而复制；采用农杆菌介导的遗传转化方法而导入的外源基因，通常都是被整合到染色体DNA中，因此由此获得的转基因植物相关性状呈孟德尔式遗传。

　　在自然界中，SV40等致癌病毒侵染后形成的DNA就是整合到宿主细胞染色体DNA中进行复制的；HIV侵入宿主细胞后经过逆转录形成DNA，形成的DNA再拼接到宿主细胞的核DNA中。

　　6、原核生物中的限制性内切酶有何作用？它为什么不剪切自身DNA？

　　作为“分子手术刀”的限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，迄今已从近300种不同微生物中分离出了约4000种限制酶。那么这些限制酶在原核生物体内有什么作用？它什么不剪切自身的DNA呢？

　　原核生物在自然界中很容易受到外源DNA的入侵，在长期的进化过程中就形成了一套完善的防御机制，以保持自身遗传的相对稳定性。限制酶就是一种防御性工具，当外源DNA侵入后，限制酶就将其切割掉，使外源DNA不能发挥遗传效应。在防御外源DNA入侵的同时，对自身DNA还具有一种保护机制。限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，它们具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列能力。甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了，所以限制性内切酶只降解外源入侵的异种DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。

　　7、植物组织培养的培养基中为什么添加蔗糖而不是葡萄糖？

　　在植物组织培养初期，由于植物组织或细胞不能进行光合作用，因此需要供给碳源和能源。不少师生提出的疑问有二：植物细胞能吸收蔗糖吗？为什么不用葡萄糖作为碳源和能源？

　　由于教材中质壁分离和复原实验的影响，不少师生认为，蔗糖不能被植物细胞吸收，其实蔗糖分子是可以进入植物细胞的。植物组织培养中，培养基中的蔗糖浓度较低，而质壁分离实验中的蔗糖浓度很高，质壁分离的时间短，细胞吸收蔗糖的量很少，在短时间内不足以影响细胞液渗透压，由此才出现壁分离现象。在蔗糖浓度较低时，蔗糖以被动扩散的形式进入植物细胞，植物细胞内有蔗糖转化酶，在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。

　　培养基中添加蔗糖而不是葡萄糖，是以大量实验为基础的。大量实验表明，蔗糖能支持绝大多数植物离体培养物的旺盛生长，因此被作为植物组织培养的标准碳源而广泛应用，大多数合成培养基也均以蔗糖作为唯一的碳源。其中的原因可能有下列几个方面：①同样作为碳源和能源物质，蔗糖较葡萄糖能更好地维持培养基内的低渗环境。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定。②植物组织培养过程中，要特别注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最适合的是葡萄糖，而较少利用蔗糖，因此采用蔗糖作为培养基的碳源，可在一定程度上减少微生物的污染。③从能源供应来说，相同物质的量浓度下，蔗糖比葡萄糖提供的能量多。

　　当然，不同植物对不同糖类的反应是不完全相同的。近年来不断有研究报道，在西黄松(Pinus ponderosa)下胚轴离体培养中葡萄糖和蔗糖对愈伤组织的生长及保持具有相同效果(Tuskan等，1990)，在白长春花(Catharanthus roseus)离体培养中，葡萄糖有较高的生物产量，但生物碱产量与使用蔗糖时相似(Flower等，1982)，在小麦花药培养中供应9%葡萄糖优于蔗糖(朱至清，1991)，等等。

　　8、单克隆抗体制备过程中，如何筛选杂交瘤细胞？

　　在单克隆抗体的制备过程中，筛选产生单一抗体的特异性杂交瘤细胞是本技术的关键步骤。在细胞混合物中含有骨髓瘤细胞、B淋巴细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞、B淋巴细胞与B淋巴细胞的融合细胞、骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞，通常采用HAT培养液进行筛选培养，由于B淋巴细胞不能在体外天然增殖，因而未融合的B淋巴细胞以及B淋巴细胞与B淋巴细胞的融合细胞不能在HAT培养液中培养。骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT—）细胞，因而未融合的骨髓瘤细胞以及骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞在HAT培养液中不能利用次黄嘌呤作为前体合成鸟嘌呤和腺嘌呤，同时在HAT培养液中加入的氨基蝶呤阻断了利用脱氢叶酸还原酶合成嘌呤的第2条代谢途径，于是它们也不能增殖生长。只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞可以在HAT培养液中增殖生长，因为杂交瘤细胞从B淋巴细胞处获取了HGPRT，可以利用培养液中的外源次黄嘌呤，而培养液中添加的胸腺嘧啶可以克服由于氨基蝶呤抑制脱氢叶酸还原酶而阻碍的嘧啶合成。这样，在细胞融合大约10～14d之后，HAT培养液中只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞能够增殖生长。由于不同效应B细胞的特异性存在差异，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体可能不同，还必须对杂交瘤细胞群进行二次筛选，才可能筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种到多孔细胞培养板上，使培养板的每孔中只有一个细胞，通过培养使细胞增殖，然后可用酶联免疫吸附试验法检测每孔上清液中细胞分泌的抗体类型。上清液中能与特定抗原结合的培养孔即为阳性孔，阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3、4次，直至确定每孔中细胞为单克隆细胞。

　　9、精子为何能群体同步成熟？青春期卵原细胞的产生最旺盛吗？减数分裂发生的时期和受精作用发生的标志是什么？

　　当原生殖细胞（primordial germ cell）到达发育中的生殖腺后，分裂形成精原细胞，并且不断增殖。而精原细胞增殖以及以后的减数分裂的两次细胞分裂，细胞质分裂是不完全的。多个细胞形成合胞体，细胞之间通过直径1μm的细胞质桥进行沟通，细胞间的离子和分子通过相互交流而相互影响，从而保证了每群细胞的同步成熟。从最初的精原细胞到精细胞的分裂过程中，细胞不断远离生精小管的基膜，接近生精小管的管腔。精细胞位于管腔的边缘，失去相互之间的细胞质桥连接，而进一步分化成精子。

　　研究发现，人类女性卵巢内细胞减数分裂在胚胎阶段就已经开始，在减数第一次分裂前期初级卵母细胞不断发育，但是被阻断在双线期。从12岁左右开始，极少数的初级卵细胞获得恢复减数分裂的信号物质，继续进行减数分裂的过程，而大多数初级卵母细胞不断死亡，有的甚至被阻断于减数第一次分裂前期长达50年之久。卵细胞具有十分复杂的细胞质体系，卵细胞含有启动个体发育和维持新陈代谢的全部物质条件，因此卵细胞必须建立一个由各种酶、mRNA、代谢产物和细胞器等组成的复杂细胞质库。一个很长的减数第一次分裂前期，可以使初级卵母细胞充分生长。有人认为，女性青春期时卵原细胞数目最多，其实不然。人类妊娠2～7月期间女性胚胎的卵原细胞由1 000个左右迅速增殖到700万个左右，在7个月后胚胎卵原细胞大多数死亡，其数量而急剧下降。存活的卵原细胞分化发育形成初级卵母细胞，并且被阻断于减数第一次分裂双线期。出生时大概有200万个左右的初级卵母细胞，而在女性一生中大概只有400个初级卵母细胞能够继续完成成熟分化。因此女性一生中胚胎时期的卵原细胞最多。

　　女性在个体发育的7个月以后的胚胎中，大多数卵原细胞不断死亡，存活的少数卵原细胞分化进入减数第一次分裂前期而形成为初级卵母细胞，并被阻断于双线期直至青春期，此期间细胞迅速生长，体积增加约100倍。在青春期获得恢复减数分裂的信号后，继续进行减数分裂，后又停留在减数第二次分裂中期。受精作用发生后，减数第二次分裂才得以继续进行。因此从真正意义上讲，整个减数分裂的过程是在受精后才完成的。有人问：判断卵细胞是否受精以观察到3个极体还是2个极体为标志？其实在人类以及大部分哺乳动物中，第一极体很少再进行减数第二次分裂，只有少部分哺乳动物的第一极体才会分裂形成2个第二极体；即使第一极体继续进行减数第二次分裂，在实际操作中也难以同时观察到3个极体，因此但凡能看到2个极体，就足以说明受精作用的发生，而受精作用完成的标志则为雌雄原核合并、染色体合为一组、完整受精卵的形成。